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Non solo Covid 19 ma HIV, HCV, CMV…

Che le nuove frontiere in microbiologia passino dal sequenziamento genico è un parere oramai condiviso: con quello che abbiamo letto e sentito su SARS-COV-2, con l’importanza che viene attribuita alla Next Generation Sequencing (NGS), l’argomento può sembrare inflazionato ma è importantissimo. Del resto un virologo e microbiologo non può che pensare di estendere l’utilizzo di questi nuovi sistemi ad altri patogeni (direzione sanitaria e budget permettendo). 

La rilevanza clinica del sequenziamento virale risale ormai a qualche anno fa e diversi approcci sono stati studiati. Per quanto riguarda la NGS andremo un pochino più nel dettaglio. Il fatto che sia stata sdoganata questa nuova tecnologia di sequenziamento però non ha solo creato un grosso bias di esecuzione/interpretazione da parte di tecnici (WET) e virologi (BIOINF + Interpretazione) ma anche, e soprattutto, dalla controparte clinica, che si ritrova a lavorare con dati molto complessi, rispetto ai quali hanno un atteggiamento più diffidente e meno pragmatico del virologo clinico. 

Come sempre si parla del microbiologo come consulente, la “preparazione” fa la differenza quando si è chiamati in un team multidisciplinare, tra infettivologi, gastroenterologi pediatri o altri. Uno dei temi più significativi riguarda i limiti  dell’utilizzo di NGS in virologia applicata. 

Il CMV ha una clinica e criteri diagnostici assai specifici. HIV invece ha un approccio più universale e, permettetemi, semplicistico, visto che è “da sempre” consigliato il sequenziamento e poi, quanto vale per HCV è applicabile ad HIV, per limiti ed opportunità. HCV è il virus piu’ interessante: è in atto un grosso progetto, a livello regionale/nazionale e mondiale, finalizzato all’eradicazione.

Nella presentazione allegata sono stati selezionati alcuni aspetti cardine, intesi come frontiera del sequenziamento nella clinica e nella ricerca. E’ fondamentale cogliere gli aspetti più pratici della discussione. Per questo dei tre virus menzionati nel titolo, la scelta predilige quello che oggi fa più discutere: HCV. Nella slide “mutuata” alla presentazione del Progetto Polaris del ”WHO”, viene sottolineata l’incidenza dei casi di HCV viremica per anno: oscillano tra lo 0.8 e l’1.1% della popolazione mondiale. Parliamo di 71 milioni di positivi e 400000 morti, per anno. 

Il Progetto OMS è molto ambizioso; sono state trattate centinaia di migliaia di persone, anche se (dati riferibili al 2019) si è ben lontani dagli obiettivi prefissati. Quando si parla di HCV, come dicono gli anglosassoni, è meglio affrontare subito l’elefante nella stanza: i nuovi DAA. Anche per questo si è scelto HCV come virus prototipo: l’introduzione di nuovi regimi di DAA (interferon, ribavirina free) offrono una Sustained Viral Response a 12 settimane tra il 97 ed il 100%, dipendente da svariati fattori. 

Per esperienza, l’interazione con i clinici ci ha insegnato che HCV ha una terapia “pan genotipica”, che non richiede controllo viremico se non a 4 e 12 settimane, in assenza di determinazione genotipica o resistenza. Questo perchè vengono sequenziate regioni predeterminate (NS3-4-5a/b) nel genoma di HCV, con primer selezionati per genotipo e con RT-PCR spinta ad un elevato numero di cicli per ottenere un segnale soddisfacente. 

Questa pratica analitica introduce un “bias” significativo data la percentuale di mutazioni associate ad una quasi-specie circolante, con cutoff al 20%. E’ difficile quindi decifrare la situazione reale. Semplificando i fattori che influenzano la risposta ai DAAs da linee guida, sicuramente la determinazione del genotipo e del sottotipo sono di assoluta importanza. Ci sono svariati metodi per determinare il genotipo: tra i più utilizzati sicuramente la PCR RT, capace di distinguere i principali genotipi, oppure sistemi che permettono una buona discriminazione tra genotipi e sottotipi,man mano che la coorte di pazienti si amplia. E’ consigliabile sempre approntare il sequenziamento quando non si ha sicurezza del dato fornito. 

HCV ha una variabilità di gran lunga maggiore, rispetto ad HIV o HBV, con genotipi che differiscono per oltre il 30% e sottotipi variabili per oltre il 15%. Sono distanze enormi in termini di filogenesi! Attualmente risultano 8 genotipi, piu di 86 sottotipi e piu di 40 isolati orfani e sappiamo che stanno emergendo forme ricombinanti (simili alle CRF di HIV, con GT2 e GT1,5 e 6). 

Le ultime linee guida della EASL sottolineano come siano importanti la geno-tipizzazione e sotto-tipizzazione, non solo per la scelta ma anche per la durata della terapia antivirale. 

Alcuni genotipi sono caratterizzati da polimorfismi di resistenza intrinseci, per esempio, riguardo gli inibitori di NS5A. I genotipi 1L, 4R, 3B, 3G, 6V e 6U risultano possedere naturalmente una ridotta suscettibilità a DAA. Le mutazioni introducono al tema della resistenza virale, definita come insieme di mutazioni genomiche che rendono il virus meno suscettibile al trattamento con un determinato farmaco.

Possono essere preesistenti (a baseline, come polimorfismi) oppure emergenti, cioè selezionate dopo il trattamento con un farmaco di successo, come per la combinazione sofosbuvir/velpatasvir. Il problema è rilevante, come riportato da un recente articolo del Gruppo del professor. Baldanti che analizza le mutazioni a baseline e successive al fallimento terapeutico, dopo utilizzo di DAA.

Una terapia non adeguata porterà alla inevitabile selezione di mutanti con aumentata fitness virale, in presenza del farmaco. Semplice Evoluzione Darwiniana!

Inoltre: la resistenza virale non è tutto o nulla. Si caratterizza per una “fold-resistance”  incrementale.

Possiamo riassumerla con tabelle che mettono in relazione genotipo, mutazioni e specifici farmaci e associare una riduzione dell’attività del farmaco alla stessa mutazione, evidenziando diversi effetti:

1. assenza o minima efficacia su un determinato genotipo (velpatasvir);

2. resistenza incrementale di 100 o 1000 volte, a seconda dell’aminoacido sostituito, in un genotipo diverso.

Ad oggi i test genetici non sono raccomandati nel trattamento del paziente naïve (linea guida WHO). Perché sequenziare quindi? La risposta: genotipo e RAS influenzano pesantemente il “clinical management” del paziente condizionando la durata della terapia (aggiunta di Ribavirina), scegliere un particolare regime di DAA (re-treatment).

Dove sono disponibili dati adeguati e di qualità, in regioni geografiche o in popolazioni in cui può ragionevolmente esserci il dubbio nell’approntare una corretta terapia empirica, il sequenziamento può guidare il “decision making” terapeutico. Nel ri-trattamento, il sequenziamento è sempre consigliato, basato secondo EASL sulla formazione di un team multidisciplinare, con virologo e clinico prescrittore.

Ad oggi ci troviamo di fronte ad una scelta diagnostica: metodologia amplicon based oppure a cattura? La cattura ha dei limiti nella carica virale minima per determinare ras o genotipo ma il dato è il più soggetto a “bias”; con una metodica amplicon based si ha una maggiore facilità di esecuzione ma si reintroducono alcuni limiti del vecchio Sanger! Il consiglio è sempre quello di analizzare i propri dati e scegliere un percorso specifico.

In conclusione, con una aspettativa di SVR superiore al 95%, il sequenziamento virale di HCV è consigliato in alcuni casi prima della terapia nel paziente naïve. E’ invece sempre consigliata nei pazienti che non raggiungono la SVR. Il sequenziamento è sempre di aiuto in presenza di sottotipi rari in popolazioni a rischio.

In conclusione: attualmente il “NGS-WGS a cattura” (senza amplificazione) rappresenta la vera frontiera del sequenziamento.

BIBLIOWEB:

Lorenzin G – Nuove frontiere (cliniche) nella diagnostica microbiologica: opportunità e limiti del sequenziamento (NGS) applicato a virus: HIV / HCV / CMV- webinar NewMicro del 26 novembre 2021- (in PDF-FlipBook allegato)
Fusaro A. – Il sequenziamento Sanger e NGS https://newmicro.altervista.org/?p=9016
Riorganizzazione laboratori ultimo step https://newmicro.altervista.org/?p=8969
ECDC spiega l’effetto paradosso https://newmicro.altervista.org/?p=8921
Screening HCV per Decreto https://newmicro.altervista.org/?p=8563
Nuove frontiere nella diagnostica Microbiologica https://newmicro.altervista.org/?p=8764
La diffusione delle varianti SARS-CoV-2 https://newmicro.altervista.org/?p=8233
Young HCV https://newmicro.altervista.org/?p=7243
COVID-19 Test di Laboratorio https://newmicro.altervista.org/?p=7193
HCV “retroattiva” https://newmicro.altervista.org/?p=5760
HCV Evidence Based https://newmicro.altervista.org/?p=5512
Le Infezioni da virus dell’ Epatite C (HCV) https://newmicro.altervista.org/?page_id=908

 Lorenzin G - Nuove frontiere (cliniche) nella diagnostica microbiologica: opportunità e limiti del sequenziamento (NGS) applicato a virus: HIV / HCV / CMV- webinar NewMicro, 26 novembre 2021 (PDF-FlipBook)

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