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Differenze, applicazioni e limiti. Confronto delle tecniche nella ricerca varianti SARS-CoV-2

Propria di tutti i virus, la formazione di varianti virali riguarda specialmente quelli con genoma a RNA. Le mutazioni genetiche che avvengono in occasione della replicazione virale sono casuali. Possono produrre diverse tipologie: una variante più aggressiva della malattia, oppure più contagiosa, o con capacità di reinfettare persone precedentemente immunizzate (malattia o vaccino).

Lo studio delle caratteristiche del genoma passa per due diverse tipologie d’esame: 1) la mappatura del genoma, che identifica i loci dei geni e la loro distanza relativa e 2) il sequenziamento del gene, che esplicita l’ordine dei nucleotidi che lo costituiscono. La mappatura produce un risultato meno dettagliato; il sequenziamento del gene fornisce invece un risultato “radicale” specificando i nucleotidi. Da qui la diffusione del secondo tipo d’esame.

Il sequenziamento genico è una delle tecniche che ha profondamente cambiato le regole e l’operatività delle Microbiologie e dei Laboratori Analisi. Consente di determinare l’ordine dei nucleotidi in piccole regioni genomiche mirate o in interi genomi, sia a DNA che a RNA. In questo modo rende possibile individuare varianti a singolo nucleotide (le mutazioni puntiformi) e altre caratteristiche più generali. Già essenziale per l’analisi delle resistenze in HIV, il Covid ha amplificato il ricorso a tale tecnica, ormai diventata il “gold standard” della pandemia, con stravolgimento operativo di molti laboratori.

Frederick Sanger è il “padre” della metodica o “metodo della terminazione della catena”: consiste nell’utilizzo di deossiribonucleotidi, privi del gruppo ossidrilico in posizione 3′, capaci di agire come codoni di “stop”. Quando un dideossiribonucleotide viene aggiunto ad un oligonucleotide in formazione da una DNA polimerasi, si ha la cessazione dell’allungamento della catena (non potendo formarsi il legame fosfodiesterico tra nucleotidi successivi). Grazie a questo metodo Sanger conseguì il premio Nobel per la Chimica, nel 1980.

Nel caso specifico del COVID-19, si è visto come il sequenziamento genico rivesta un ruolo centrale non solo nell’identificazione del virus, ma anche nello studio delle dinamiche dell’epidemia, inclusi i cambiamenti nel tempo, nello spazio e nelle vie di trasmissione. Inoltre, l’analisi delle sequenze genomiche può aiutare nella progettazione di test diagnostici, farmaci e vaccini e nel monitorare i cambiamenti della loro efficacia nel tempo, se dipendenti da mutazioni genomiche.

In biologia molecolare esistono diverse tecniche di sequenziamento: la più conosciuta è quella tipo “Sanger” ed altre più recenti ed avanzate. Nel complesso sono note come NGS (Next Generation Sequencing) e permettono di identificare microrganismi patogeni senza una conoscenza preliminare degli stessi, come nel caso dei nuovi ceppi di coronavirus.

Abbiamo proposto il webinar dello scorso novembre anche con l’intenzione di “fissare” almeno una parte delle nozioni indispensabili a “comprendere” questa nuova metodica. Proprio l’aspetto didattico della relazione mi ha spinto a riproporre il contributo di Alice Fusaro, che ringrazio sia per la disponibilità dimostratami nel partecipare al webinar sia per aver fornito le diapositive che presentiamo, a completamento dell’articolo.

La sua relazione ci aiuta a chiarire perché è importante sequenziare SARS Cov-2: identificare e monitorare l’emergere di varianti virali, ha potenziali effetti sulla salute pubblica grazie all’associazione dei dati genetici a quelli epidemiologici, fornendo delle mappe geografiche in aree delimitate. L’esempio realizzato (e illustrato) riguarda il Veneto. Diventa così chiaro il concetto di “contact tracing”, di investigazione delle dinamiche di trasmissione, come pure lo “spillover”, il passaggio da una specie all’altra.

Le varianti per cui esiste una comprovata associazione con la la situazione epidemiologica per trasmissibilità o virulenza, vengono identificate dalla sigla VOC (Variant Of Concern). Le circolari ministeriali utilizzano proprio tale dizione per fornire le indicazioni dello “stato dell’arte” sull’andamento della pandemia.

I giornali e le riviste affrontano il tema covid ed il sequenziamento con fortunate sintesi, come quella fornita dalla Gabanelli per il Corriere della Sera (al 15 dicembre 2021). Il sequenziamento è oramai essenziale quando parliamo di esami. Non a caso anche nel Dl Sostegni-Bis (riorganizzazione della rete dei laboratori pubblici e privati accreditati) viene istituito un finanziamento ad hoc ed una soglia minima di 5.000 campioni/anno esaminati con la tecnologia Next Generation Sequencing (NGS).

Non possiamo non adeguarci!

BIBLIOWEB:

Fusaro A. – Il sequenziamento Sanger e NGS – Atti del webinar Nuove frontiere nella diagnostica microbiologica – 26 novembre 2021 (in PDF-FlipBook allegato)
Ministero della Salute – Circolare del 17 gennaio 2022 – Stima della prevalenza delle varianti VOC (Variant Of Concern) e di altre varianti di SARS-CoV-2 in Italia (in infografica)
ECDC Covid variants https://www.ecdc.europa.eu/en/covid-19/variants-concern
Riorganizzazione laboratori ultimo step https://newmicro.altervista.org/?p=8969
Bronchiolite e RSV https://newmicro.altervista.org/?p=8958
Linee Guida per la pelle 2021  https://newmicro.altervista.org/?p=8906
ECDC spiega l’effetto paradosso https://newmicro.altervista.org/?p=8921
Covid 19 e salute di genere https://newmicro.altervista.org/?p=8894
OCSE Focus Pandemia https://newmicro.altervista.org/?p=8877
Nuove frontiere nella diagnostica Microbiologica https://newmicro.altervista.org/?p=8764
La diffusione delle varianti SARS-CoV-2 https://newmicro.altervista.org/?p=8233
COVID-19 Test di Laboratorio https://newmicro.altervista.org/?p=7193

 Fusaro A – Il sequenziamento Sanger e NGS – Atti del webinar Nuove frontiere nella diagnostica microbiologica – 26 novembre 2021 (PDF-FlipBook)

 Un Click per Leggere

 ISS – G. Rezza: “Stima della prevalenza delle varianti VOC (Variant Of Concern) e di altre varianti di SARS-CoV-2 in Italia”, gennaio 2022 (PDF)

 Un Click per Leggere